基金申請(qǐng)技巧講座[第四軍醫(yī)大學(xué) 蘇景寬.ppt

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基金申請(qǐng)技巧講座第四軍醫(yī)大學(xué)科研部蘇景寬
第一部分 如何撰寫申請(qǐng)書
一、摘  要（限400字）包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義。
        采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。通過基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細(xì)胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。
二、立論依據(jù)
       對(duì)基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國(guó)際科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)，
        論述科學(xué)意義
        對(duì)應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍
        繞國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中的重要科技問題
        論述應(yīng)用前景
       在立論依據(jù)的闡述中，對(duì)研究領(lǐng)域、研究方向、              具體科學(xué)問題的理解       研究領(lǐng)域：白內(nèi)障的研究，包括發(fā)病機(jī)制、預(yù)防、診斷、                             治療措施等研究        研究方向：白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究，包括環(huán)境因素、致病                          靶點(diǎn)、細(xì)胞水平、分子水平研究等        科學(xué)問題：白內(nèi)障發(fā)病過程中的相關(guān)基因研究，包括致病                          基因篩選、功能研究、調(diào)控機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等

  1、項(xiàng)目的研究意義
          存在問題：對(duì)科學(xué)意義的闡述不足或夸大
         撰寫方法：
          從領(lǐng)域入手，提出主要問題，引出熱點(diǎn)研究方向。
          圍繞熱點(diǎn)研究方向進(jìn)行簡(jiǎn)要分析，找出目前尚未解決的具體科學(xué)問題，以此為切入點(diǎn)提出假設(shè)，闡述如果解決了該問題（研究目標(biāo)），對(duì)該領(lǐng)域甚至相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)貢獻(xiàn)（理論意義或應(yīng)用前景）。
   
         老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增
   加，其發(fā)病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化，
   白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。目前，它已是人類
   第一位的致盲疾病。迄今為止, 治療白內(nèi)障唯一有效的
   方法是通過手術(shù)摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。
   雖然手術(shù)后患者可以恢復(fù)良好的視力，但是不可避免的
   術(shù)后并發(fā)癥以及手術(shù)設(shè)備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障
   所花費(fèi)的資金已成為世界各國(guó)包括富裕的發(fā)達(dá)國(guó)家嚴(yán)重
   的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的
   發(fā)病時(shí)間延緩10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會(huì)減少45%[1]。
   所以，一些學(xué)者認(rèn)為通過預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展
   的途徑征服白內(nèi)障已成為一項(xiàng)全球性的社會(huì)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)
   問題[2]。
         但是目前我們對(duì)老年性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)還不十分清楚。多年以來許多學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)晶狀體上皮細(xì)胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對(duì)其中進(jìn)一步的基因調(diào)控知之甚少。如果從參與老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的相關(guān)基因入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點(diǎn)，以晶狀體上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達(dá)的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對(duì)其功能進(jìn)行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。
    2、國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀分析（與綜述的區(qū)別）
        存在問題：
      A、低水平重復(fù)：不了解最新進(jìn)展，對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)
           狀缺乏真正了解，提出的問題別人已解決。
      B、文獻(xiàn)復(fù)習(xí)不全：檢索文獻(xiàn)方法不當(dāng)、選擇關(guān)鍵詞
           不妥，甚至人為縮小檢索范圍。
      C、總結(jié)表達(dá)不夠：對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏歸納分析，  
           只是簡(jiǎn)單羅列，缺乏邏輯性和針對(duì)性。
      D 、對(duì)方法原理理解不夠：對(duì)研究方法不熟悉，簡(jiǎn)
           單移植或夸大其作用，缺乏實(shí)際應(yīng)用的可行性。
  
        撰寫方法：要緊緊圍繞本次申請(qǐng)項(xiàng)目的主題。
    A、從領(lǐng)域切入，簡(jiǎn)要論述國(guó)內(nèi)外研究成果，并引
         出當(dāng)前的熱點(diǎn)研究方向。
    B、從研究方向展開，較詳細(xì)地分析國(guó)內(nèi)外的研究
         進(jìn)展，闡明在該方向上存在的問題。
    C、圍繞存在的問題，結(jié)合國(guó)內(nèi)外以往的研究結(jié)果、
         當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢(shì)，詳細(xì)論述和分
         析這些問題產(chǎn)生的原因，提出該方面的空白點(diǎn)、
         未知數(shù)、以及研究的難點(diǎn)、焦點(diǎn)，從而為自己
         申請(qǐng)項(xiàng)目確立研究目標(biāo)奠定充分的立論基礎(chǔ)。
   D、對(duì)擬采用的技術(shù)方法進(jìn)行介紹和分析。
         成熟的方法重點(diǎn)介紹可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
          新方法在詳細(xì)介紹其原理的基礎(chǔ)上，闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
          需特別注意的問題：必須對(duì)所運(yùn)用的技術(shù)方法的原理、流程尤其是在實(shí)際運(yùn)用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚，絕不能是一種簡(jiǎn)單的移植。
          例如：抗體 + 功能基團(tuán)，理論上可以實(shí)現(xiàn)融合，但存在“活性、表達(dá)載體選擇、純化等問題。
   E、提出本項(xiàng)目的研究設(shè)想。
          防治白內(nèi)障必須針對(duì)其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理。就致病的環(huán)境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。就研究的部位分，晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細(xì)胞在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。
         因?yàn)榫�狀體上皮細(xì)胞是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細(xì)胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，對(duì)維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細(xì)胞還是晶狀體中受外來刺激影響較早的部位，已有研究證實(shí)老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞還發(fā)生退行性變、細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡細(xì)胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異[3-5] 。
       體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)多種因素(H2O2、UV-B、晶狀體蛋白的自身抗體)誘發(fā)的白內(nèi)障模型中晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié)[6-8]。因此，從晶狀體上皮細(xì)胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié)。而晶狀體上皮細(xì)胞變化的基因調(diào)控機(jī)制是問題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。
          白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果，包括基因的和非基因的隨機(jī)變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機(jī)性的組織特異性多種基因表達(dá)的改變。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面：
           一是對(duì)體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細(xì)胞的研究。UV-B輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細(xì)胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表達(dá)增加；還有組蛋白H4、H3  的低表達(dá)`和蛋白酶C、β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白基因的高表達(dá)[9-12]。Carper等[13]利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技術(shù)研究H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細(xì)胞的基因差異性表達(dá)結(jié)果顯示NADH脫氫酶4亞基、細(xì)胞色素b、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)減少以及細(xì)胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、β-三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達(dá)的增加。
          二是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究。波形纖維蛋白基因（vimentin）、雜交的Ⅲ型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢(shì)。晶狀體改變的共同特點(diǎn)是晶狀體纖維細(xì)胞分化受抑制[14,15]。Gong等[16]報(bào)告晶狀體的細(xì)胞膜蛋白連接蛋白α3（α3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶狀體形成的早期及纖維細(xì)胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。  
         雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)告。
          三是對(duì)人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Lee[17]利用RT-PCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白、I型膠原纖維、α-平滑肌蛋白、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βⅡ型受體、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)有差異。Kantorow等[18]利用RT-PCR-DD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達(dá)的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障有三個(gè)高表達(dá)基因和12個(gè)低表達(dá)的基因。但就DD-PCR技術(shù)來講，在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性、假陽性以及克隆全長(zhǎng)cDNA的問題。
        上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。
          尋找白內(nèi)障時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。
         尋找差異表達(dá)基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（subtractive hybridization, SH），它是……，但是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。
          經(jīng)過改進(jìn)后的抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）……簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，但仍然問題很多。
          我校生化教研室建立了改良消減雜交技術(shù)[19，20]，其特點(diǎn)是：簡(jiǎn)便易行，能夠獲得目的細(xì)胞特異表達(dá)的全長(zhǎng)基因，對(duì)低豐度基因也能有效分離。  
       該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中5個(gè)為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，并克隆到全長(zhǎng)cDNA，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。
        基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測(cè)差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效�；�因芯片是在1996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的DNA探針集中到1厘米見方的基片上，利用堿基互補(bǔ)原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測(cè)定的未知DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動(dòng)閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而對(duì)檢測(cè)基因進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。
         由于目前尚沒有針對(duì)白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立cDNA文庫，再利用基因芯片技術(shù)制備成基因芯片，以此檢測(cè)多個(gè)樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，從中進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基因，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。

         綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。本項(xiàng)目從晶狀體上皮細(xì)胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞和在體晶狀體上皮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們?cè)诰�狀體上皮細(xì)胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。
    3、參考文獻(xiàn)    A、文獻(xiàn)類別要全：以英文文獻(xiàn)為主，同時(shí)也要引用           中文文獻(xiàn)--- 國(guó)內(nèi)同行中知名專家的文獻(xiàn)。    B、引文信息要全：文章題目、作者姓名、具體出處         （包括期刊名、年份、卷期、頁碼等）。    C、文獻(xiàn)年代要新：主要是近五年的文獻(xiàn)，最好能有          07年的最新文獻(xiàn)。
三、研究方案
    1、研究目標(biāo)
         撰寫要求：  有限目標(biāo)，與研究?jī)?nèi)容相呼應(yīng)   
   2、研究?jī)?nèi)容：
     存在問題：內(nèi)容過多，一個(gè)研究周期難以完成
                   內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)
         撰寫要求：內(nèi)容要適當(dāng)—確保研究周期內(nèi)完成
                   為目標(biāo)服務(wù)—與目標(biāo)相輔相成
                   要重點(diǎn)闡述—注意與技術(shù)路線區(qū)別
         
    舉例：
          （1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因片段，建立cDNA文庫。制備差異表達(dá)基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個(gè)標(biāo)本的老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。
        （2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)：……
        （3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細(xì)胞變化中的作用：……
           觀察指標(biāo)如下：
          ①存活細(xì)胞數(shù)；②光鏡、透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化；③細(xì)胞凋亡檢測(cè)：用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo)PCR方法，從形態(tài)和DNA水平分析細(xì)胞凋亡；④細(xì)胞增殖的檢測(cè)：……；⑤細(xì)胞骨架蛋白的檢測(cè)：……；⑥晶狀體蛋白的檢測(cè)：
   3、擬解決的關(guān)鍵問題：
        存在問題：抓不住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)。
            什么是關(guān)鍵問題 ？
            --研究過程中對(duì)達(dá)預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些研究
              內(nèi)容或因素。
           --為達(dá)預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或研究手段。
           撰寫要求：找出關(guān)鍵問題，提出解決辦法。
   舉例：
  （1）建立差異表達(dá)的cDNA文庫：
          建立差異cDNA文庫是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。為使差異cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案：
          ①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標(biāo)本（擬取50例標(biāo)本）作為建庫的mRNA的來源。
          ②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表達(dá)的完整cDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)中已積累了較豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。
（2）制備基因芯片：
        制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關(guān)鍵是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時(shí)做到：①嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行；②在標(biāo)本的處理及RNA提取時(shí)避免污染，否則即會(huì)造成嚴(yán)重的損失。只要嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行操作就可以避免發(fā)生差錯(cuò)。
    （3）在體基因轉(zhuǎn)染：
        在體基因轉(zhuǎn)染是進(jìn)行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。在體的晶狀體上皮細(xì)胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤道前區(qū)的少量細(xì)胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質(zhì)的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大量分裂后細(xì)胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對(duì)以上問題我們擬采取下列方法解決：①選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒載體（ lentiviral vector ），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細(xì)胞的局限性，對(duì)分裂后細(xì)胞也能有效的轉(zhuǎn)染。這對(duì)在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染有很大的優(yōu)越性。②采用直徑1-2μm玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細(xì)胞。
4、研究方法
       存在問題：
         過于簡(jiǎn)單：在方案中只有方法名稱而無具體步驟。
         過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法。
         撰寫要求：以研究項(xiàng)目的需求為前提，盡量采用最適合的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。
   5、技術(shù)路線
        存在問題： 不清楚，不詳細(xì)，不可行。
          撰寫要求： 清晰、詳細(xì)、注意邏輯性。
          撰寫方法：
—以時(shí)間順序?yàn)橹骶�設(shè)計(jì)技術(shù)路線
—以研究?jī)?nèi)容為主線設(shè)計(jì)技術(shù)路線
—分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。
—詳細(xì)地寫清楚每個(gè)具體步驟。
        （1）人晶狀體上皮細(xì)胞的獲得：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊膜（晶狀體上皮細(xì)胞緊貼于前囊膜），直徑約5mm。正常晶狀體上皮細(xì)胞取自角膜移植供體眼的晶狀體，在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8mm。按文獻(xiàn)提供的方法去除晶狀體纖維細(xì)胞，仔細(xì)清洗以去除血細(xì)胞污染。
         （2）建立差異cDNA文庫：從50例白內(nèi)障手術(shù)患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為對(duì)照組，利用改良的消減雜交技術(shù)[19，20]，獲得差異表達(dá)的cDNA，并建立文庫。主要的實(shí)驗(yàn)流程如下：
     正常晶狀體上皮細(xì)胞        白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞
                Promega PolyATtract® System 1000
        mRNA分離                     mRNA分離
oligo-dT18反轉(zhuǎn)錄      ntech Cap-finder方法反轉(zhuǎn)錄                                                         
           cDNA            
                Biotin-21-dUTP            pending-cDNA
     隨機(jī)引物PCR  
                                   雜交
                                    Sephacryl S-400柱
                       
                        除鹽及小片段
                        鏈親和素-生物素磁性分離
除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細(xì)胞cDNA
                                            “長(zhǎng)距離”PCR
                     目的cDNA的特異擴(kuò)增
                                克隆、鑒定、轉(zhuǎn)化
                       建立差異基因文庫
（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：
        ① 基因芯片的制備： ………
        ②白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選：……
（4）白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析：
        ① 序列測(cè)定：... ...
        ② 序列的計(jì)算機(jī)分析： ... ...
        ③ 獲得全長(zhǎng)基因： ... ...
（5）基因轉(zhuǎn)染：
        ① 培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：……
        ② 在體晶狀體的轉(zhuǎn)染：……
  6、可行性分析
            對(duì)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的分析
         理論分析
         研究手段方法分析
         預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
         對(duì)相關(guān)條件的分析
         所用特殊實(shí)驗(yàn)材料（試劑）的分析
         對(duì)所具備的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析
         對(duì)項(xiàng)目組成員搭配及其運(yùn)用技術(shù)方法的能力分析
(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫：
         老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞是處在不同狀態(tài)下的細(xì)胞，細(xì)胞基因表達(dá)的改變
   是細(xì)胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基
   因是探索細(xì)胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口。利用的
   消減雜交技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的有效方法。改良
   的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用
   此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表
   達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其
   中 5個(gè)為新基因，這一研究成果進(jìn)一步證實(shí)了該方法
   的可操作性，而且我們?cè)谶\(yùn)用此方法過程中也積累了
   較豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此，本研究利用這一方法從兩種狀
   態(tài)的晶狀體上皮細(xì)胞中篩選差異表達(dá)的基因并建立
   cDNA文庫是可行的。
7、創(chuàng)新性
     存在問題： 對(duì)創(chuàng)新點(diǎn)提煉不夠
                       把運(yùn)用新技術(shù)、新方法理解為創(chuàng)新
                       與研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容相混淆
       對(duì)創(chuàng)新的理解：
       原始創(chuàng)新：填補(bǔ)空白或修改傳統(tǒng)的理論
                  發(fā)明創(chuàng)造新技術(shù)、新方法
       跟蹤創(chuàng)新：補(bǔ)充、完善現(xiàn)有理論
                  修改、完善現(xiàn)有技術(shù)方法（1＋1＞2）
  提煉方法：用逆向思維方法提煉創(chuàng)新點(diǎn)
   （1）基因篩選方法上的創(chuàng)新：
         首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫，并制備相應(yīng)的基因芯片，利用此基因芯片篩選出老年性白內(nèi)障相關(guān)基因。上述兩種方法的有機(jī)結(jié)合使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得多個(gè)白內(nèi)障相關(guān)基因。通過分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的功能，揭示老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。
   （2）基因功能研究上的創(chuàng)新：......

  （1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ):
          本研究所用的基因篩選技術(shù)主要是改良的消減雜交技術(shù)，此技術(shù)是我們研究組成員主要參與建立的，并利用此技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中5個(gè)為新基因，有關(guān)此技術(shù)的研究論文有：......
   （2）有關(guān)基因轉(zhuǎn)染方面的研究工作基礎(chǔ)：......   
  （3）有關(guān)老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的研究基礎(chǔ)：......
    2、工作條件        實(shí)驗(yàn)室整體實(shí)力和規(guī)模（地位、課題、成果等）          實(shí)驗(yàn)室所具備的與申請(qǐng)項(xiàng)目相關(guān)的主要儀器設(shè)備          實(shí)驗(yàn)室所在單位具備的申請(qǐng)項(xiàng)目所需的實(shí)驗(yàn)條件    3、項(xiàng)目組人員簡(jiǎn)歷        所有人員均需介紹（重點(diǎn)是項(xiàng)目負(fù)責(zé)人）          介紹內(nèi)容根據(jù)在項(xiàng)目中的分工有所側(cè)重          列出與申請(qǐng)項(xiàng)目相關(guān)的研究論文及成果
第二部分撰寫申請(qǐng)書時(shí)常見問題解析
    1、對(duì)立論依據(jù)、實(shí)驗(yàn)方案、研究基礎(chǔ)應(yīng)闡述的內(nèi)容         以及三者關(guān)系的理解          立論依據(jù)：闡述背景和理由，回答“為什么”                 實(shí)驗(yàn)方案：是申請(qǐng)書的核心，回答“怎么做”          研究基礎(chǔ)：展示積累和實(shí)力，回答“做了啥”
    2、對(duì)研究目標(biāo)的確定       國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀分析中提出的具體科學(xué)問題就是項(xiàng)目的研究目標(biāo)，研究目標(biāo)具體到什么程度，要根據(jù)研究周期、資助強(qiáng)度來確定。
3、研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容、研究方法的關(guān)系        依據(jù)目標(biāo)確定研究?jī)?nèi)容         根據(jù)內(nèi)容選擇研究方法
5、對(duì)擬解決的關(guān)鍵問題與可行性分析撰寫時(shí)的區(qū)別
      二者相同之處：擬解決的關(guān)鍵問題在可行性分析時(shí)也要提及
      二者不同之處：
      撰寫擬解決關(guān)鍵問題，重點(diǎn)回答如何解決。
              解決辦法包括：通過研究思路的設(shè)計(jì)巧妙
                                       運(yùn)用最新出現(xiàn)的研究方法
                                       通過不同方法各自優(yōu)點(diǎn)的有機(jī)結(jié)合
       在進(jìn)行可行性分析時(shí)，重點(diǎn)回答能夠解決。
              分析問題角度：通過對(duì)現(xiàn)有理論分析提供理論依據(jù)
                                       通過對(duì)預(yù)研結(jié)果分析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)
                                       通過對(duì)他人研究成果描述提供佐證
6、創(chuàng)新點(diǎn)、研究目標(biāo)和預(yù)期研究結(jié)果的區(qū)別
          三者的共同點(diǎn)：都包含一個(gè)“新”字。
          三者的不同點(diǎn)：概念的外延不同。
          創(chuàng)  新  點(diǎn)： ① 形態(tài)學(xué)證實(shí)在腦下垂體中確有神經(jīng)纖維存在
                             ② 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)是肽能神經(jīng)
          研究目標(biāo)：通過各種形態(tài)學(xué)研究充分證明在腦下垂體中確
                            有肽能神經(jīng)支配
          預(yù)期研究結(jié)果：提出腦下垂體肽能神經(jīng)和體液雙重調(diào)節(jié)                     
                            假說，對(duì)原有理論提出挑戰(zhàn)。
      二、尚需注意的幾個(gè)問題      
        1、在項(xiàng)目設(shè)計(jì)過程中要樹立整體觀念，要
                講述一個(gè)完整的故事。
          2、文字表達(dá)要精雕細(xì)琢，每一句話說明什么
               要做到心中有數(shù)。
          3、文獻(xiàn)回顧不能回避國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展，
               尤其是不同學(xué)派的觀點(diǎn)。
          4、重點(diǎn)內(nèi)容、觀點(diǎn)要用黑體強(qiáng)調(diào)。   
第三部分基金申報(bào)相關(guān)規(guī)定及要求
一、 基金申報(bào)管理規(guī)定
申請(qǐng)者基本資格：項(xiàng)目的實(shí)際負(fù)責(zé)人；正式受聘，年工作不少于六月；在職研究生只可申請(qǐng)面上項(xiàng)目
限項(xiàng)規(guī)定：高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的科技工作者申請(qǐng)與承擔(dān)（含參加）面上、重點(diǎn)、重大等類別基金項(xiàng)目的數(shù)量（不包括執(zhí)行期一年及在一年以內(nèi)的基金項(xiàng)目）累計(jì)不得超過三項(xiàng)
面上項(xiàng)目管理辦法
面上項(xiàng)目包括自由申請(qǐng)項(xiàng)目、青年科學(xué)基金項(xiàng)目和地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目，資助期限一般為三年
面上項(xiàng)目的申請(qǐng)采取集中受理方式
申請(qǐng)者須符合《規(guī)定》要求，并具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)或已獲得博士學(xué)位。具有中級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)但未獲得博士學(xué)位的研究人員，經(jīng)兩名具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的同行專家推薦，亦可申請(qǐng)。在職研究生作為申請(qǐng)者須征得導(dǎo)師同意
青年科學(xué)基金項(xiàng)目的申請(qǐng)者限在受理申請(qǐng)當(dāng)年1月1日未滿35周歲，并且未曾獲得該類項(xiàng)目的資助
申請(qǐng)者同期只能申請(qǐng)一項(xiàng)，每個(gè)項(xiàng)目的申請(qǐng)者限為一人。申請(qǐng)者和具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的項(xiàng)目組主要成員，當(dāng)年申請(qǐng)及承擔(dān)（含參加）在研的面上項(xiàng)目數(shù)合計(jì)不得超過兩項(xiàng)。不具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的申請(qǐng)者，當(dāng)年申請(qǐng)及負(fù)責(zé)在研的面上項(xiàng)目數(shù)合計(jì)不得超過一項(xiàng)，但參加項(xiàng)數(shù)不限
研究經(jīng)費(fèi)是指直接用于科學(xué)研究的費(fèi)用。
科研業(yè)務(wù)費(fèi)：測(cè)試計(jì)算分析費(fèi),動(dòng)力能源費(fèi),差旅費(fèi),調(diào)研和學(xué)術(shù)會(huì)議費(fèi),資料、論文版面費(fèi)和印刷費(fèi),文獻(xiàn)檢索、入網(wǎng)等信息通訊費(fèi),學(xué)術(shù)刊物訂閱費(fèi)
實(shí)驗(yàn)材料費(fèi):原材料、試劑、藥品等消耗品購置費(fèi),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、植物的購置、種植、養(yǎng)殖費(fèi),標(biāo)本、樣品的采集加工費(fèi)和包裝運(yùn)輸費(fèi)
儀器設(shè)備費(fèi):專用儀器設(shè)備購置、運(yùn)輸、安裝費(fèi)和修理費(fèi),自制專用儀器設(shè)備的材料、配件購置費(fèi)和加工費(fèi)
實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi):不得用于實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)建、土建、房屋維修等費(fèi)用的開支
協(xié)作費(fèi):外單位協(xié)作承擔(dān)自然科學(xué)基金項(xiàng)目部分研究試驗(yàn)工作的費(fèi)用
國(guó)際合作與交流經(jīng)費(fèi)：直接關(guān)系的國(guó)際合作與交流費(fèi)用,包括項(xiàng)目組人員出訪及外國(guó)專家來訪的部分費(fèi)用
勞務(wù)費(fèi)：用于直接參加項(xiàng)目研究的研究生、博士后人員的勞務(wù)費(fèi)用
管理費(fèi)：項(xiàng)目依托單位為組織和支持項(xiàng)目研究而支出的費(fèi)用,包括項(xiàng)目執(zhí)行中公用儀器設(shè)備、房屋占用費(fèi)等
二、2007版申請(qǐng)書注意事項(xiàng)
建議正文編輯方式
使用 Word 錄入、編輯和排版需要錄入的申請(qǐng)書正文部分內(nèi)容。完成編輯后，將該文件命名保存
打開申請(qǐng)書文件，光標(biāo)定位在正文中需要插入內(nèi)容的位置
選擇 “插入”下拉菜單中的“文件”插入功能，選擇包含申請(qǐng)書正文內(nèi)容的文件，將其內(nèi)容全部導(dǎo)入到申請(qǐng)書中（不要使用剪貼板功能進(jìn)行文件內(nèi)容導(dǎo)入）
2007年面上項(xiàng)目申請(qǐng)資助經(jīng)費(fèi)  
30萬元/項(xiàng)
形式審查要點(diǎn)：12個(gè)確認(rèn)
確認(rèn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人申報(bào)資格
確認(rèn)申請(qǐng)書為2007版
確認(rèn)提交和打印電子文檔時(shí)已“檢查保護(hù)”
確認(rèn)電子版的版本號(hào)與紙質(zhì)文件完全一致
確認(rèn)申報(bào)學(xué)科選擇正確，項(xiàng)目信息填報(bào)完整無誤
確認(rèn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人和項(xiàng)目組成員親自簽字
形式審查要點(diǎn)：12個(gè)確認(rèn)
確認(rèn)參與多個(gè)項(xiàng)目的人員身份和提法一致
確認(rèn)項(xiàng)目組成員統(tǒng)計(jì)人數(shù)與填報(bào)人數(shù)一致
確認(rèn)正文中流程圖及插入圖片位置、形式正確
確認(rèn)電子郵箱暢通，以便及時(shí)查閱郵件
確認(rèn)所有附件材料完整并已經(jīng)盡量電子化
確認(rèn)A3紙雙面套印，蓋章頁放在最后
  謝  謝！



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